前言
乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisB virus , HBv ）引起的傳染性疾病，在我國人群中感染率較高，，是嚴(yán)重危害人民身體健康的常見傳染病之一。對(duì)乙肝的診斷主要以實(shí)驗(yàn)室檢測乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）為主，檢測方法主要有酶免疫法、反向間接血凝法、放免法、化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法等，目前應(yīng)用較廣、較普及的是酶免疫法。本標(biāo)準(zhǔn)所使用的縮略語為HBV 、HBsAg 。
本標(biāo)準(zhǔn)從2002 年7 月1 日起實(shí)施。
本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部醫(yī)政司提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部人民醫(yī)院肝病研究所負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陶其敏、全文斌。
本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)解釋。
中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
中華人民共和國衛(wèi)生部2002-04-20 批準(zhǔn)       2002-07-01 實(shí)施
乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗(yàn)方法
WS / T 223 一2002
Guidelines for enzyme immuno 一assay of hepatitis B surface antigen
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血清HBsAg 酶免疫檢驗(yàn)方法（兩步法）中相關(guān)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各基礎(chǔ)、臨床實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)研究中血清HBsAg 測定。
2 方法選擇
2 . 1 常用方法
HBsAg 的酶免疫檢驗(yàn)方法根據(jù)反應(yīng)模式可分為“一步法”和“兩步法”兩種方法。“一步法”是將待測樣品和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加人到反應(yīng)孔中進(jìn)行反應(yīng)，從而達(dá)到快速的目的；“兩步法”則是先將樣品加人到反應(yīng)孔中，待反應(yīng)結(jié)束后再加人酶標(biāo)記抗體，從而使待測樣品的“捕獲反應(yīng)”和酶標(biāo)記抗體的“酶聯(lián)反應(yīng)”分開進(jìn)行，因而反應(yīng)更加穩(wěn)定、重復(fù)性也更好。
2 . 2 推薦方法
由于“一步法”存在產(chǎn)生“前帶現(xiàn)象”的可能，故在本標(biāo)準(zhǔn)中不列為推薦方法；本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用酶免疫“兩步法”。
2 . 3 方法原理
本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用酶免疫“兩步法”檢測HBsAg ：將抗HBs 的單克隆抗體（簡稱單抗）或多克隆抗體（簡稱多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相載體上，加人待測血清，如其中含有HBsAg ，則可與固相上的包被抗體結(jié)合；洗板去除不參加反應(yīng)的無關(guān)蛋白成分后，加人酶（如辣根過氧化物酶）標(biāo)記的第二株抗體使之與血清中HB 、Ag 反應(yīng)，在固相載體上形成包被抗體一血清中HBsAg 一酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物（即雙抗體夾心）；再加人底物后，酶催化底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色反應(yīng)顏色的深淺可判定血清樣品中HB 、Ag 的有無及相對(duì)含量。
3 試劑和材料
國內(nèi)目前已有成套的試劑盒供應(yīng)。
顯色反應(yīng)底物液可選用鄰苯二胺（o-phenylenediamine 。OPD）過氧化氫（H202 。）溶液（簡稱OPD ）或3 , 3 ' , 5 , 5 ’-四甲基聯(lián)苯胺（3 , 3 ' , 5 , 5 ’一Tetramethylbenzidine , TMB ）-H2O2 溶液（簡稱TMB ）。使用OPD 時(shí)，可選用2mol / l的硫酸（H2SO4 ）作為終止液，比色時(shí)選用492nm 作為測定波長；使用TMB 時(shí)，可選用2 mol / l的鹽酸或2 mol / l 的硫酸溶液作為終止液，比色時(shí)選用450 nm 作為測定波長。注:國內(nèi)市場目前亦有HBsAg 檢測的快速酶免疫試劑盒供應(yīng)，該試劑盒系加有標(biāo)本加速劑和酶標(biāo)記抗體加速劑，可達(dá)到快速反應(yīng)的目的，具體操作方法詳見各生產(chǎn)廠家的試劑盒說明書。
4 儀器和設(shè)備
包括酶標(biāo)儀、移液系統(tǒng)（移液器及移液器頭）和恒溫設(shè)備（水浴箱）等。所選用的儀器設(shè)備應(yīng)滿足以下要求：
a ）酶標(biāo)儀在450 nm 和492 nm 的波長不精密度應(yīng)在≤1 %，分別在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之間，吸光度（A 值）要求可以測到小數(shù)點(diǎn)后兩位；
b ）移液系統(tǒng)在100μl和50 μl 的移液不精密度應(yīng)≤1 % ，分別在99- 101μl 和49.5μl-50.5μl 之間；
c ）恒溫系統(tǒng)在37 ℃ 、43℃ 的溫度變異應(yīng)成士I℃ 。
樣品
5 . 1 血液樣品的采取
取受試者的前臂靜脈血。止血帶的使用時(shí)間應(yīng)不超過1 min ，同時(shí)避免溶血。
5 . 2 血液樣品的處理、貯存和測定前準(zhǔn)備
血液樣品采取后室溫下靜置30 min-45 min 使其凝血，避免溶血，2 O00r / min 離心5 min 后立刻吸出血清置密封的試管中貯存。
分離出的血清標(biāo)本可于2℃-4℃ 貯存1 周，如需貯存更長時(shí)間，則應(yīng)保存在-20℃ 以下，用時(shí)提前取出融化并使其溫度升至室溫，充分混勻后測定。保存在－20℃ 的標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則可能會(huì)影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
注：HBsAg 的檢測亦可用血漿類標(biāo)本，其抗凝劑可選用拘椽酸鈉（106 mmol / L 的水溶液與血液按1： 9 比例使用）、乙二胺四乙酸二鈉（15g / l ，的水溶液與血液按1： 9 比例使用）、肝素（100 u / mg ～ 125 u / mg 的肝素鈉粉劑配成1g/L的水溶液與血液按1 : 9 比例使用）等。
6 測定步驟
6 .1測定前準(zhǔn)備
將貯存的成套試劑盒及待測血清樣品取出，使其溫度升至室溫后混勻使用。
準(zhǔn)備或開啟儀器設(shè)備。
6 . 2 測定操作
a ）已包被好的微孔反應(yīng)板中每孔加人待測血清50μl ，每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陰性、陽性對(duì)照及空白孔，37C 水浴或恒溫箱保溫30min;
b ）洗板3-5 次，每次均將各孔中注滿洗液，靜置20s以上，傾去液體，拍干；
c ）每孔中加人酶標(biāo)記的抗體50μl ，保溫同前，洗板3-5 次，同前；
d ）每孔加人顯色底物液50μl , 37C 避光反應(yīng)15 min -20 min 后加人終止液50μl。）酶標(biāo)儀測定結(jié)果。
測定結(jié)果的表述和有效性判斷
7 . 1 測定結(jié)果的表述
加人終止液后，用空白孔校零，再讀取各孔的A 值，凡標(biāo)本的A 值／陰性對(duì)照均值》 2 . 1 者判定為HBsAg 陽性，反之為陰性。
7．2 測定結(jié)果的有效性判斷
陰性對(duì)照及陽性對(duì)照孔所測A 值應(yīng)在試劑盒的要求范圍內(nèi)，否則應(yīng)分析原因后重新測定。
注
1所得結(jié)果應(yīng)表示至小數(shù)點(diǎn)后2 位；
2陰性對(duì)照均值為陰性對(duì)照各孔所測定A 值的均值，其CV 值應(yīng)＜15 % ;
3 陰性對(duì)照均值<0.05 時(shí)按0.05 計(jì)算，> 0.05 時(shí)按實(shí)測值計(jì)算。
8 靈敏度、精密度和特異性
8 .1靈敏度
本方法的靈敏度一般應(yīng)≥1 ng / ml ,應(yīng)可檢側(cè)出adr 、adw 、ayw 三種亞型的HBsAg 。
8 . 2 精密度
應(yīng)用本方法對(duì)同一份樣品進(jìn)行檢測（> 10 孔），批內(nèi)CV值應(yīng)＜15 ％。
8 . 3 特異性
血清樣品中的抗壞血酸、血紅蛋白等物質(zhì)可能為本方法的干擾物質(zhì)，生理水平的上述物質(zhì)應(yīng)不明顯影響測定結(jié)果，某些試劑的配方設(shè)計(jì)和測定方式應(yīng)可不同程度地減少上述物質(zhì)的干擾。
9 安全注意事項(xiàng)
血清樣品和來源于血液的質(zhì)控物質(zhì)都可能含有致病微生物，應(yīng)視為有傳染性的物質(zhì)，必須按傳染病實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程進(jìn)行操作，避免吞人口中或與皮膚接觸。